双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的镀铬蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的0有使用价值的核心方法。

准备试剂

提示：使用电泳级试剂制备以下溶液：

A : 50 ml IEF 裂解缓冲液

1.将 21 g 尿素添加到 3镀铬5 ml HPLC 级 H2O 到 50 ml Falcon 管（0终浓度 7 M）中。

2.剧烈涡旋几分钟。

3.添加：

4.添加 10 µl 三丁基膦 2 mM 。

5.添加溴酚蓝作为指示剂。

6.定容体积镀铬为 50 毫升。

7.涡旋直到全部溶解（或将管连接到旋转器）。

8.将 1 ml 分装到微量离心管中。

9.储存在-20°C。

B：10X 电泳运行缓冲液 (10 L) 0.25 M Tris、1.92 M 镀铬甘氨酸、1M SDS

1.将 300 g Tris-base、1441 g 甘氨酸和 10 g SDS 添加到 ~7 L HPLC 级 H2O。

2.轻轻混合直至溶解。

3.定容体积达到 10 升。

C：30镀铬% 丙烯酰胺原料（1 升）

1.添加 292 g 丙烯酰胺和 8 g 哌嗪二丙烯酰胺 (PDA) 到 700 ml HPLC 级 H2O。

2.搅拌溶解。

3.使体积达到 1 L。

4.通过 0.45 µm 镀铬孔径过滤器过滤。

5.4°C 避光保存。

D：分离丙烯酰胺凝胶

以下是制备 9-18% 梯度凝胶所需的溶液体积。为要运行的凝胶数量准备足够的体积。

E：50 ml 平衡缓冲液 I

1.将 18 g 尿素和 10镀铬 ml 0.5 M Tris-HCl，pH 6.9 混合在一起。

2.大力旋涡。

3.加入 10 ml 20% SDS 和 200 mg DTT。

4.轻轻翻转几次。

5.加入 15 毫升甘油。

6.剧烈涡旋（镀铬或将管连接到旋转器上 10-15 分钟）。

7.添加溴酚蓝作为指示剂。

F：50 ml 平衡缓冲液 II

与平衡缓冲液 I 相同，除了添加 5.0 g 碘乙酰胺代替 DTT。

G：传输缓冲器

对于 1 L：

25镀铬 mM Tris-HCl (3 g)

190 mM 甘氨酸 (14.44 g)

20% 甲醇 (200 ml)

实验阶段

第一天：样品制备

A. 组织处理

•裂解从石蜡包埋块中获得的 5-8 µm 组织切片：

1.镀铬将组织切片放入 1.5 ml Eppendorf 管中。

2.添加二甲苯以覆盖组织。

3.大力涡旋约 15 秒。

4.在 RT 孵育 5 分钟。

5.再次漩涡。

6.向下旋转 3 分钟以沉淀组织。

7.去除二甲苯镀铬。

8.加入 1 毫升二甲苯。

9.涡旋 5-10 秒。

10.减速。

11.去除二甲苯。

12.将样品快速抽真空几分钟以蒸发剩余的二甲苯。

13.添加 400 µl IEF 缓冲液。

14.剧烈涡旋 1 分钟。

1镀铬5.在 RT 孵育 5 分钟。

16.剧烈涡旋 1 分钟。

17.在室温下以 14,000 g 离心 5-10 分钟。

B. Reswelling

1.从 -20°C 取出 Immobiline Drystr镀铬ips (Amersham Pharmacia Biotech)，并在室温下平衡。

提示：所用试纸条的 pH 范围应与 IEF 裂解缓冲液中使用的 Pharmalytes 或 IPG 缓冲液的 pH 范镀铬围相同。

2.在条带的基本端开槽以标记每个样品。

3.将第一个样品装入 Reswelling 托盘。

4.将 DryStrips 凝胶面朝下放入每个槽中。

5.用移液器吸头向下按压去除气泡。

6.用 DrySt镀铬rip Cover 液完全覆盖。

7.对每个样品重复上述步骤，包括 MW 标准品（2-D SDS-PAGE 标准品，pH 范围 4.5-8.5，MW 17,500-76,000）。

8.如果样品集中在条带镀铬的一个区域，请通过移液器重新分配。

9.用盖子盖住托盘。

10.在 RT 下孵育过夜，以使条带吸收样品。

第二天：第一维度

1.清洁电泳室 (Pharmacia LKB Multiphor II) 和 Imm镀铬obiline 胶条托盘，并用纸巾和 Kimwipes 擦去矿物油。

2.将托盘放在 50 ml DryStrip Cover 液体上。

3.移除条带。

4.放在 Whatman 纸上，凝胶面朝上。

提示：将镀铬条带凝胶面朝下放置可能会导致蛋白质损失和凝胶损坏。

5.离开〜1分钟。

6.凝胶面朝上放入电泳室。

7.排列条带，使它们的边缘在一条线上。

提示：时间对于防止结晶很重要。

8.用 HPLC 级 H2O 润湿预制镀铬的 IEF 电极条。

9.在两张 Whatman 纸之间稍微晾干。

10.将 2 条缓冲条放在条带的两侧并垂直于它们，覆盖每侧溴酚蓝的顶部。

11.确保每个条带的方形端在阴极（黑色/-）端，尖端在阳极（红色镀铬/+）端，并且阳极和阴极电极脊的方向正确。

12.在固定带之间和电极外部大量覆盖 DryStrip Cover 液体。

13.电泳 36-48 小时，使用以下设置顺序：

至少 1 小时内应看到溴酚蓝向阳极迁镀铬移。到第二天，条带应该是无色的。如果到第二天溴酚蓝仍未消失，则可以暂停运行并从任一侧更换电极条。继续运行直到染料消失。

第三天：第二维度

A：准备仪器

1.用肥皂和热水很好地清洗和擦洗盘子。

2.在 diH2镀铬O 中冲洗。

3.让板风干或用甲醇浸泡的 Kimwipes 擦拭。

4.在 Protean-II 多凝胶浇注室中加入丙烯酸块填充。

5.拧紧螺丝。

6.胶带室的边缘，以防止泄漏。

B：制备梯度丙烯酰胺凝胶（9-镀铬18%）

1.将 9% 的凝胶溶液添加到分配器的中心隔间（混合室），将 18% 的凝胶添加到外围隔间（储液室）。

2.启动混合室中的磁力搅拌器。

3.慢慢打开阀门，去除管道中的气泡。

4.让管道充满凝胶溶液，镀铬然后关闭阀门。

5.打开搅拌器。

提示：搅拌棒应位于混合室和储液室之间的开口之间，但不能位于它们的顶部。

6.打开混合室和储液室之间的阀门（向上）。

7.确保 18% 的溶液流入混合室。

8.打开阀门以开始丙烯镀铬酰胺溶液流入 Protean 室。

9.允许合理流动。快速流动会导致梯度损失，而缓慢流动会导致管道中的溶液聚合。此外，由于压力的变化，流速随时间变化。但是，腔室应在至少 10 分钟内充满。

10.当凝胶距镀铬离玻璃板顶部 0.5 cm 时停止。

11.使用注射器用 HPLC 级 H2O 仔细覆盖凝胶。

12.盖上保鲜膜。

13.允许聚合过夜。

第四天：第二维度（续）

1.移除条带。

2.放在 Whatman 纸上，凝镀铬胶面朝上 1 分钟。

3.在平衡缓冲液 I 中平衡 10-15 分钟。

4.在电泳室（Protean II Multi-cell，Bio-Rad）中设置凝胶。

5.确保没有泄漏。

6.在平衡缓冲液 II 中平镀铬衡试纸条。

7.移除条带。

8.一张一张地放在 Whatman 纸上，凝胶面朝上。

9.识别缺口。

10.从两侧切割〜一英寸。

11.将凝胶放置在靠近阳极（红色/+）的碱性侧和靠近阴极（黑色/-）的酸性侧以保持镀铬一致。

12.以 40 mA/凝胶运行凝胶 15 分钟或直到染料前沿进入凝胶约一英寸。

13.调低电压并在 65-70 V 恒定电压下运行过夜。（如果赶时间，将电源设置为 360 mA 和 500 V 并镀铬运行 8 小时）。

第五天：蛋白质的转移和测序

A：转移到 PVDF 或硝酸纤维素膜上

1.将凝胶浸泡在转移缓冲液中 5-10 分钟。

2.将预切割的转印膜和 Whatman 纸浸泡在转印缓冲液中。

3.用转移镀铬缓冲液润湿转移装置。

4.在转印装置底部放置 3-4 张 Whatman 纸。

5.将膜放在顶部并去除气泡。

6.将凝胶放在膜的顶部并去除气泡。

7.将 3-4 张 Whatman 纸放在凝胶顶部并去除所有气镀铬泡。

8.在不超过 25V 的电压下转移 3 小时（每平方厘米凝胶/膜 1-1.5 mA）。如果超过 5-6 个凝胶，则转移 5 小时。

B：凝胶染色

参见染色方案

C：蛋白质斑点的切除（用于 MS 测序）

提镀铬示：在引擎盖下工作以防止凝胶暴露在过多的空气中，从而避免角蛋白污染

1.施乐凝胶并指定要测序的点。

2.用移液器吸头切出用于测序的蛋白质点。

3.移至微量离心管。

4.用移液器吸头切碎凝胶片。

5.在凝胶片中加镀铬入 50% 甲醇/10% 乙酸溶液。

6.孵育 30 分钟。

7.减速。

8.去除上清液。

9.样品已准备好进行质谱测序。