一、目的要求

掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法和测定果蔬组织中蛋白质分子量的基本原理和实验技术。

二、基本原理

由于植物学来源和发育程度不同，果蔬组织的蛋白质种类、含量与组成成分等各方面差异非常大。常镀铜常需要利用电泳技术进行研究果蔬蛋白质的变化。十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS镀铜-PAGE）是一种能够分离和测定蛋白质组成的电泳方法，主要用于测定蛋白质亚基分子质量。

带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。若以V代表球形分子在电场中的移动速度，E代表电场强度，q为带电镀铜粒子所带电荷量，粒子半径为r，溶液粘度为η，则V=Eq6πrη，即电泳速度与电场强度和颗粒所带电荷量成正比，而与颗粒的大小、溶液的粘度成反比。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状镀铜，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同功酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷不同，在电场中的运动速度也不同。

聚丙烯酰镀铜胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，ACr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N′-methylena bisacrylamide，BIs）在引发镀铜剂（过硫酸铵，AP）和催化剂（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺Tetramethylenedismine，TEMED）的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。镀铜氧能抑制聚合反应，可根据实验情况决定是否在聚合前对凝胶混合物进行脱气。ACr和BIs的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100 mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为镀铜凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中凝胶剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用C%表示。用公式表示如下：

式中a为ACr的质量（g），b为Bis的质量（g），m为凝胶溶液总体积（mL）。当a/b（W/镀铜W）＜10时，形成的凝胶脆、硬，呈乳白色；a/b＞100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶，a/b要控制在30左右。通常T在2~5%时，a/b＝20左右；T在5~10%时，a镀铜/b＝40左右；T在15~20%时，A/B=125~200左右。T在3~25%的范围内，凝胶易发生聚合。根据材料及目的蛋白的不同选择凝胶浓度。

凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数镀铜量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的阴离子去污剂——十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS），能打开蛋镀铜白质分子的氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束（protein-SDS micelles），使蛋白质分子表面完全被负电荷所覆盖，且所带电量远远大于蛋白质分子原镀铜有的电荷量，掩盖了蛋白质间原有的电荷差异；同时在水溶液中，蛋白质-SDS胶束成椭圆棒短轴形，其长度与亚基分子量的大小成正比，因此在SDS电泳体系中，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷性镀铜质无关。在条件一定时，将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按镀铜照凝胶电泳系统中的缓冲液、pH值和凝胶孔径的差异可分为SDS-连续系统电泳和SDS-不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可以分为SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直管型电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝镀铜胶垂直板型电泳两类。本实验采用SDS-不连续垂直板型操作方法。

三、材料、仪器及试剂

（一）材料

苹果、梨、番茄等果实；菠菜、香菜等蔬菜。将材料洗浄去除表面土粒和灰尘待用。

（二）仪器及用具

电泳仪1套（稳压电镀铜源、垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃，见图7）、台式高速离心机、水浴锅、离心管、移液器（5 mL、1 000 μL、100 μL、50 μL）、烧杯若干（100 mL、50 mL）、容量瓶（1 000 m镀铜L、100 mL）、研钵、玻璃棒、滤纸、20 mL培养皿2个（或用白瓷盘代替，染色用）、海绵块、摇床、镊子。

（三）试剂

1．Solution A（Acr/Bis贮备液）

称取30.0 g丙烯酰胺（Acr）镀铜，0.8 g甲叉双丙烯酰胺（Bis），溶解后定容至100 mL，即得30%（w/v）Acr-0.8%（w/v）Bis贮备液。

2．Solution B（4×分离胶缓冲液）

又称下层缓冲液，为1.5 mol镀铜/L pH 8.8 Tris-HCL缓冲液。配制方法：称取18.17 g Tris溶于30 mL蒸馏水中，用1 mol/L HCl调节pH至8.8，定容至100 mL。

3．Solution C（4×浓镀铜缩胶缓冲液）

又称上层缓冲液，为0.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCL缓冲液。配制方法：称取6.1 g Tris溶于40 mL蒸馏水中，用1 mol/L HCl调节pH至6.8，定容至100 镀铜mL。

4．10%过硫酸铵（AP）

称取1.0 g 过硫酸铵溶于6 mL蒸馏水中，稀释至10 mL。用时现配或4 ℃冰箱保存。

5．四甲基乙二胺（TEMED）；

使用原液，避光低温保存。

6．电极缓冲液

称取3.0镀铜 g Tris、14.4 g甘氨酸（Gly）、1.0 g SDS溶于蒸馏水，用1 mol/L HCl调pH至8.3，稀释至1 000 mL，即为25 mmol/L Tris—192 mmol/L Gly—镀铜0.1% SDS、pH 8.3的电极缓冲液。

7．提取缓冲液

100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCL缓冲液：称取1.21 g Tris，溶于40 mL蒸馏水中，用1 mol/L HCl调节pH镀铜至7.5，再用蒸馏水稀释、定容至100 mL。

8．10%（w/v）SDS

称取1.0 g SDS溶于少量蒸馏水，稀释、定容至10 mL，室温保存。

9．样品缓冲液（见表25）

表25．样品缓冲液配制表

10．镀铜染色液

称取0.5 g考马斯亮蓝R-250，用225 mL乙醇、50 mL乙酸溶解，再用蒸馏水稀释、定容至500 mL。

11．脱色液

取50 mL乙醇，50 mL乙酸，加水至500 mL。

12．标准分子量镀铜蛋白质溶液

按照试剂说明书配制。

13．饱和正丁醇

14．20%三氯乙酸（TCA）溶液

四、实验步骤

（一）样品制备

称取2.0~5.0 g果蔬样品组织，加入5 mL提样缓冲液，研磨匀浆后于4℃ 12 000×g离镀铜心20 min，收集上清液即为可溶性蛋白质的粗提液，于4 ℃保存备用。

（二）凝胶制备

1．模具安装

取两块电泳玻璃板（其中一块有凹槽，另一块有夹条，根据所需凝胶厚度选择1或1.5 mm厚的夹条），用热去污剂镀铜洗净后，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻璃板内面要避免手指触摸以防沾污。选择配套的1或1.5 mm厚的胶条，并用胶条将两侧及底端封好。将玻璃板用塑料楔子固定于电泳槽上，模具安装完毕。

2．配胶

根据需要从表镀铜26中选择适当浓度值，本实验选用10%的分离胶胶浓度。先配制分离胶（注意先不加AP和TEMED试剂）。在配制好以后，加入30 μL AP和8 μL TEMED。

3．灌分离胶、压线

混匀后立即沿无凹槽的玻镀铜板用移液器将分离胶缓缓注入胶室中，注胶过程要防止气泡产生。胶液加到离凹槽3 cm处为止，立即用移液器轻轻在胶溶液上面铺1 cm高的饱和正丁醇或蒸馏水压线，但不要扰乱丙烯酰胺胶面。待分离胶之上出现清晰的镀铜界面时，表示聚合已完成。然后，用移液器小心吸出上层覆盖的饱和正丁醇或蒸馏水。注意，吸出正丁醇后还要用蒸馏水反复冲洗胶面数次，并用滤纸吸干表面残留的水。

4．灌浓缩胶

按照表26配制浓缩胶，配制好后加入30镀铜 μL AP和8 μL TEMED，混合后立即加到分离胶上层，插入预先选择好的样品梳（10或15孔，1或1.5 mm厚），注意不要带入气泡。

（三）电泳

1．样品提取液处理

取20 µL样品提取液，置于1.5镀铜 mL离心管，再加入等体积的样品缓冲液，混合后于100 ℃沸水浴中煮沸5 min，然后于10 000×g离心5 min以除去加热过程沉淀了的蛋白质，收集上清液纪委上样用样品液。

2．上样

取下样品梳（注意镀铜不要拉断样槽隔墙）并抽出夹条，将制好的凝胶板夹在电泳槽上并向内外槽注入电极缓冲液。用移液器针头或上样枪头吸取样品液，插入样品槽下部慢慢进样，每槽点样10-50 μl（根据具体情况不同），但是各上样槽应镀铜保证相同的样品体积。

3．电泳

红线接电源正级，黑线接电源负级，将电泳仪电压调至75 V，电泳至溴酚蓝标志到达浓缩胶与分离胶交界处并成一条细直线时，调整电压至150 V进行电泳，直至溴酚蓝标志到达凝胶前沿镀铜为止，停止电泳并切断电源。

电泳结束后，取下玻板，用刀轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），取出凝胶，并做好标记记住左右顺序。

4．固定

取出电泳胶片后，放在20%三氯乙酸溶液中浸泡30min，使蛋镀铜白质固定。

5．染色

将凝胶胶片放入染色液中，置于摇床上摇动60 min左右。

6．脱色

倾倒出染色液，用蒸馏水冲洗胶两遍，然后加入脱色液，置于摇床上进行脱色。若要加快脱色速度可在脱色盒子中放一块海绵。

（四）镀铜结果保存

将脱过色的凝胶照像或扫描后作为实验报告的凭证。作为学生实验报告可用绘图或制作干胶的方法记录蛋白谱带。方法为：裁下2张比胶片四边长3 cm左右的玻璃纸在水中浸湿后，先将一张平铺在玻璃板上，放上凝镀铜胶片，再盖上另一张，用玻棒赶走气泡，将玻璃纸边缘折向玻板底部，用另一块同样大小的玻璃板压住，再用夹子夹住两端固定，室温下避光放置1天左右即可，然后取下干胶，修剪整齐保存。

绘图表示：将各蛋白带按颜色深浅镀铜绘成谱带图。

（五）计算相对迁移率（Rf值），估算目标蛋白的分子量

根据电泳结果在胶上直接测量或在电泳图谱上测量各蛋白的迁移率，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率。以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标，标镀铜准蛋白质分子量的对数为纵坐标，绘制标准蛋白质的标准曲线，再根据样品相对迁移率在曲线上求出待测样品蛋白质亚基的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。

五、注意事项

1．ACr和BIs是神经性毒剂，且镀铜对皮肤有刺激作用。配制贮液、配胶、灌胶操作时，要戴上医用乳胶手套或指套，避免与皮肤接触。只要细心操作，一般不会引起损伤。

2．ACr和BIs的纯化

精确的定量分析和制备电泳需要纯度更高的ACr和BIs，其镀铜提纯方法如下：

（1）ACr重结晶方法 将ACr溶于50℃氯仿中（70 g/L），趁热过滤，滤液冷却至20 ℃，结晶。用冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶。用冷氯仿淋洗结晶，真空干燥。纯ACr的熔点为84.5±镀铜0.3℃。

（2）BIs重结晶方法 将12 g BIs溶于1 000 mL 40~50 ℃的丙酮中，趁热过滤，滤液逐渐冷却至20 ℃，用冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶。用冷丙酮淋洗，真空干燥。纯BIs的熔点镀铜为185 ℃。

3．10%SDS需放置在常温下，低温会有SDS析出。

4．配制考马斯亮蓝R-250染色液时，先加乙醇和部分水，用磁力搅拌器充分搅拌30 min，待考马斯完全溶解后再加入乙酸，0后加水定容至镀铜500 mL。

5．若用水压线时可能会导致分离胶靠近浓缩胶一侧被水稀释，浓度变低，呈现梯度胶。

6．大气中的氧能氧化自由基而终止聚合反应，故注胶液时应尽量避免带入气泡。注胶液完毕后应赶尽气泡。