01电泳发展简史

1809年首次发现电泳现象。1909年首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。1937年创造了 Tiselius 电泳仪，首次开发蛋白质电泳。1948 年 Wieland 和 Fisch镀镍er 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行研究。1950 年 Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝镀镍胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959 年 Raymond 和 Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳。

02电泳介绍

电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸镀镍等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含镀镍量的方法。

电泳法可分为自由电泳（无支持物）及区带电泳（有支持物）两大类。自由电泳包括显微电泳、等电聚焦电泳，等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳包括滤纸电泳、薄层电泳、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带镀镍电泳、凝胶支持体区带电泳（琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶）等。

03电泳装置介绍

电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。

04琼脂糖凝胶电泳

1、简介

琼脂糖凝镀镍胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳的分析原理与其他支持物电泳0主要区别是：它兼有“分镀镍子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大镀镍大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

2、优点

（1）电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

（2）结构均匀镀镍，含水量大，近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

（3）透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱镀镍，便于定量测定，制成干膜可长期保存。

3、缺点

（1）具有比较差的机械强度，容易破碎，浓度不可以过低。

（2）容易受到细菌的污染，保存不方便，配置的时间需要临近使用的时间。

（3）琼脂糖支持层上的区带很容易扩镀镍散，电泳必须马上固定染色。

（4）比PAGE区带小，分子筛作用小。

05影响电泳的因素

DNA分子的大小：DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的镀镍效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳块（超螺旋＞线性DNA）一般来说分子带的电荷量越大、直径越小，形态越接近球形，则其电泳迁移速度越快。凝胶浓度：浓度越大，分子孔径就越镀镍小，DNA迁移率就越低，反之迁移率就大，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的DNA片段就越小。DNA的构象：一般迁移速率超螺旋环状＞线状DNA＞单链开环。使用的电压：低电压时，线状镀镍DNA片段的迁移速率与所加电压成正比，使分辨效果好所加电压不应超过5-8V/CM。琼脂糖的种类:标准琼脂糖与低熔点琼脂糖其分辨率等各有不同。电泳缓冲液：溶液PH值距离其等电点越远，其所带净电荷就越大，镀镍电泳速度也越大，尤其是对蛋白质等两性分子，缓冲液的PH值还会影响其电泳方向。溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至镀镍熔化，也会使DNA变性。

06实验流程

1、配胶

（1）胶浓度：根据样品分子大小选择合适胶浓度。

（2）电泳缓冲液：提供一定的离子强度和溶液的PH值。

50×TAE(Tris-乙酸缓冲液)1×TAE5×TBE（镀镍Tris-硼酸缓冲液）0.5×TBE10×TPE（Tris-磷酸缓冲液）1×TPE

（3） 常用染料（EB、SYBR）：插入核酸结构，吸收紫外光产生荧光。

2、溶胶

（1）电泳缓冲液要和用于制胶的缓冲液一致镀镍

（2）制胶量和凝胶浓度要精确，总液体不宜超过三角锥形瓶50%容量。

（3）在微波炉里加热时不可放置过久，加热时胶液剧烈沸腾发泡，要停止加热。

（4）必须保证琼脂糖完全溶解，否则胶图会模糊不清。

（5）胶凝固镀镍的时间需半小时以上。

（6）染料含有致癌物质，注意戴好手套。

3、制胶板

制胶板：根据待检测样本数量，体积大小以及后续实验用于检测还是回收，来选用合适的胶板大小，样本孔大小和胶厚度。

4、上样/制样

（1）制样镀镍：样本与适当体积的凝胶上样缓冲液混匀。

（2）上样：凝胶上样缓冲液：6X loading buffer/10X loading buffer。

（3）作用：含有溴酚蓝，使样本带颜色，起指示作用，指示样本迁镀镍移过程；含有蔗糖和甘油，增加样本密度，使样本沉入样品口底部。

（4）DNA marker：主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题，通过其大小可以粗略估算样品DNA分子镀镍量的大小。

5、电泳

琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA镀镍片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的0大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。

电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通镀镍常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。

6、检测

凝胶成像仪：主要用于蛋白质、核酸凝胶成像及分析，系统提供白光和紫外光以及蓝光光源进行拍摄凝胶，由系统自带的图镀镍像捕捉软件捕捉拍摄图像，然后由系统自带的图像分析软件对拍摄的图像进行分析。

07常见问题

1、DNA条带模糊，拖尾

（1）DNA 降解。避免核酸酶污染。

（2）DNA 上样量过多。减少凝胶中 DNA 上样量。镀镍

（3）电泳缓冲液陈旧: 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

（4）电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃ ,巨镀镍大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

（5）DNA 样含盐过高。电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

（6）有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。

（7）DNA 变性。电泳前勿加热，用镀镍20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

2、DNA 条带淡弱或无 DNA 带

（1）DNA 的上样量不够：增加 DNA 的上样量。

（2）DNA 降解：避免 DNA 的核酸酶污染。

（3）DNA 走出凝胶：缩短镀镍电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

（4）分子大小相近的 DNA 带不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。

（5）DNA 变性：电泳前请勿高温加热 DNA 链，用 20mM NaCl Buffer稀镀镍释DNA 。

（6）DNA 链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。

3、DNA MARKER 条带扭曲

（1）配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液镀镍面1－2mm 即可。

（2）电泳时电压过高。可以在电泳前 15 分钟用较低电压 (3V/cm)，等条带出孔后，再调电压。

（3）尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。